GPM - Therapie Tierschutz

Dopingrelevanz des Arzneimitteleinsatzes beim Pferd

Nulllösung oder Grenzwert? Pharmakokinetische Überlegungen

M. Kietzmann, M. Düe , M. Machnik

Das Vorhandensein sowie die Gabe einer jeden Substanz, die geeignet ist, die aktuelle und die natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes während des Wettkampfes zu beeinflussen, sind wie auch die Anwendung jeglicher anderer Methoden und Eingriffe mit dem Ziel der Leistungsbeeinflussung im Pferdesport (Deutsche Reiterliche Vereinigung [FN], Direktorium für Vollblutzucht und Rennen [DVR], Hauptverband für Traberzucht und Rennen [HVT]) grundsätzlich verboten. Der Begriff Doping beinhaltet dabei auch die Verabreichung von Mitteln, die geeignet sind, den Nachweis dopingrelevanter Substanzen zu beeinträchtigen. Die FN unterscheidet in ihren Bestimmungen Dopingsubstanzen im eigentlichen Sinn von sogenannten „verbotenen“ Arzneimitteln; daneben bestehen für bestimmte Arzneimittelgruppen Ausnahmen (z.B. Endoparasitika, Impfstoffe, Paramunitätsinducer).

Zu den Dopingsubstanzen im eigentlichen Sinn gehören mit Stimulantien, Sedativa, Narkotika und Anabolika Stoffe, die die Leistungsfähigkeit eines Pferdes zum Zeitpunkt des Wettkampfes direkt beeinflussen beziehungsweise beeinflussen können. Bei den „verbotenen“ Arzneimitteln handelt es sich um all die Stoffe, die bei Pferden aus therapeutischen Gründen eingesetzt werden, die aber auf Grund ihrer Wirkung auf die unterschiedlichen Organsysteme Dopingrelevanz haben (beispielsweise nicht steroidale Antiphlogistika, Glucocorticoide). Es sind solche Substanzen verboten, welche eine der in den Dopinglisten aufgeführten pharmakologischen Wirkungen direkt oder indirekt als Haupt- oder Nebenwirkung entfalten. Hier gilt, dass ein Pferd als gedopt anzusehen ist, wenn bei Dopingkontrollen eine beliebige Menge einer verbotenen Substanz oder eines ihrer Metaboliten im Gewebe oder in den Körperflüssigkeiten nachgewiesen wird. Gerade in Anbetracht aktueller Fälle hat dieser Sachverhalt die Diskussion bezüglich der sogenannten „Nulllösung“ erneut entfacht. In diesem Zusammenhang wird von verschiedenen Seiten die Forderung nach Grenzwerten erhoben. Aus unterschiedlichen Gründen – zum Beispiel wegen des natürlichen Vorkommens im Organismus oder aber wegen einer möglichen Aufnahme mit dem Futter – sind für Testosteron, Cortisol, Nandrolon, Boldenon, Theobromin, Salicylsäure, Arsen, Dimethylsulfoxid und verfügbares CO 2 von den verschiedenen Pferdesportverbänden Grenzwerte festgelegt. Ansonsten gilt der bloße Nachweis eines dopingrelevanten Stoffes (konzentrationsunabhängig) derzeit als positiver Befund (sogenannte „Nulllösung“).

Diese heute geltende „Nulllösung“ (Nulltoleranz) bedeutet, dass sich zum Zeitpunkt eines Wettkampfes keine körperfremde Substanz im Körper des Pferdes befinden darf. Jeder Nachweis eines „verbotenen“ Stoffes stellt einen Verstoß gegen Dopingbestimmungen dar. Ausreichend für die Feststellung des Verstoßes ist damit allein ein qualitativer Nachweis eines entsprechenden Stoffes im Urin oder Blutplasma eines Pferdes – unabhängig von der gefundenen Konzentration. Die Konzentration im Plasma ist zwar in der Regel mit der Wirkung besser korreliert als die Urinkonzentration; allerdings sind die nachzuweisenden Stoffe in aller Regel im Urin angereichert, damit in höherer Konzentration nachzuweisen und besser und länger zu detektieren, so dass zumeist der Urin für Dopinguntersuchungen verwendet wird.

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Unabhängig von der verwendeten Matrix (Blutplasma, Urin) kommt der durch die analytischen Möglichkeiten bestimmten Nachweisgrenze entscheidende Bedeutung zu (Abb. 1). Als Nachweisgrenze (limit of detection, LOD) ist die niedrigste in einer Probe enthaltene Konzentration definiert, die mit dem verwendeten Analysenverfahren bei eindeutiger Identifizierung des entsprechenden Stoffes klar vom Leerwert zu unterscheiden ist. Die Nachweisgrenze wird durch die Empfindlichkeit des verwendeten analytischen Verfahrens bestimmt. Mit der Fortentwicklung der analytischen Möglichkeiten gelingt es allerdings, immer niedrigere Konzentrationen von Stoffen in einer biologischen Matrix sicher nachzuweisen. Dies bedeutet, dass die Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze mit Verbesserung der analytischen Möglichkeiten immer länger wird. Es stellt sich die Frage, ob ein Festsetzen von Grenzwerten oder auch ein „Einfrieren“ der Nachweisgrenze (z.B. auf dem Stand der heute gegebenen Möglichkeiten) sinnvoll ist, um Behandlungen von Sportpferden nicht durch zu empfindliche Messmethoden grundsätzlich in Frage zu stellen oder sogar nahezu unmöglich zu machen. Ein solcher Ansatz ist allerdings nur dann sinnvoll, wenn die nachgewiesenen Substanzmengen keine pharmakologische Wirkung mehr entfalten.

Im Gegensatz zur „Nulllösung“ erfordert die Festsetzung von „Grenzwerten“ von Seiten der Analytik allerdings nicht nur die reine Identifizierung (qualitativer Nachweis), sondern auch eine exakte Quantifizierung einer Substanz bzw. seiner Metaboliten mit einem validierten Analysenverfahren. Beim so genannten „Grenzwertkonzept“ kommt somit der Bestimmungsgrenze eines Stoffes (limit of quantification, LOQ), die als die Konzentration definiert wird, die in einer Probe eindeutig zu quantifizieren ist, Bedeutung zu (Abb. 1). Die Bestimmungsgrenze ist gemäß EHSLC (2002) bei der Konzentration erreicht, bei der die Abweichung des mittleren Messergebnisses vom Referenzwert weniger als 20 % beträgt.

Neben den durch die analytischen Möglichkeiten vorgegebenen nachweisbaren Konzentrationen wird als Basis für ein von der „Nulllösung“ abweichendes Konzept für therapeutisch bedeutsame Stoffe auch die Ermittlung einer Konzentration vorgeschlagen, bei der eine pharmakologische Wirkung nicht mehr gegeben ist. Im Rahmen von Dopinguntersuchungen, für die diese Konzentrationen festgelegt wären, wäre es daher im Gegensatz zur „Nulllösung“, bei der ein qualitativer Nachweis ausreicht, zwingend erforderlich, den jeweiligen Stoff oder seine Metaboliten mit entsprechend validierten Messverfahren eindeutig und quantitativ zu bestimmen. Die Bestimmungsgrenze liegt oberhalb der Nachweisgrenze; beide Werte können im Einzelfall jedoch auch übereinstimmen. Da alle Analysenmethoden im niedrigeren Konzentrationsbereich eine größere Streuung aufweisen als in höheren Konzentrationen, kommt der Methodenvalidierung größte Bedeutung zu, damit das jeweilige Analysenergebnis nicht anfechtbar ist. Liegt die Bestimmungsgrenze (LOQ) beispielsweise bei 10 ng/ml und streut die Methode in diesem Messbereich um 20 %, so kann erst bei einem Nachweis von mehr als 12 ng/ml davon ausgegangen werden, dass in der jeweiligen Probe sicher mehr als 10 ng/ml enthalten sind. Wären also 10 ng/ml als Grenzwert definiert, so könnten in dem entsprechenden Labor nur Untersuchungsergebnisse als positive Dopingnachweise eingestuft werden, bei denen mehr als 12 ng/ml nachgewiesen wurden.

Einen für ein von der „Nulllösung“ abweichendes Konzept zu berücksichtigenden Wert stellt die Konzentration dar, bei der eine pharmakologische Wirkung sicher ausgeschlossen ist. Mit einem hierzu von Toutain und Lassourd (2002) vorgeschlagenen Berechnungskonzept (PK/PD-Modell, Pharmakokinetik/Pharmakodynamik-Modell) wird ein Quotient aus Dosis und Clearance unter der Vorgabe einer intravenösen Applikation verwendet, um eine effektive Plasmakonzentration (EPC) zu errechnen (s. Abb. 2). Diese wird wiederum unter Verwendung eines Sicherheitsfaktors in eine ineffektive Plasmakonzentration (IPC) umgerechnet. Schließlich berechnen Toutain und Lassourd (2002) aus der IPC eine ineffektive Urinkonzentration (IUC). Hierzu multiplizieren sie die IPC mit einem Quotienten R ss, den sie aus der Plasma- und Urinkonzentration im Steady State ermitteln. Dieses Berechnungskonzept ist nach Angabe der Autoren für Stoffe geeignet, die eine mit der Plasmakonzentration korrelierte pharmakologische Wirkung entfalten. Für Stoffe, deren Wirkung beispielsweise zeitverzögert auftritt (z.B. Glucocorticoide), kann mit Hilfe dieser Berechnungen keine IUC ermittelt werden. Probleme bestehen bei der skizzierten Berechnung hinsichtlich der Berechnung einer EPC, der Festlegung des Sicherheitsfaktors sowie der Ermittlung des Quotienten R ss . So zeigen die in Tabelle 1 aufgeführten Beispiele, dass Wirkungsdauer und Ausscheidungszeit nicht korreliert sind. Dies hängt auch damit zusammen, dass die Verteilung des Arzneistoffs, welche für die am Wirkort erreichte Konzentration wesentlich ist, nicht in die Berechnung eingeht. Für verschiedene Stoffe (nach eigenen Untersuchungen z.B. für die a 2 -Agonisten Romifidin und Detomidin, s.u.) wird nach Toutain und Lasourd (2002) eine IUC errechnet, die noch unterhalb der Nachweisgrenze des jeweiligen Stoffes liegt, so dass jeder Nachweis (unabhängig von der gemessenen Konzentration) als positiver Dopingbefund zu interpretieren ist.

Obwohl das PK/PD-Modell wertvolle Hilfestellung bei der Abschätzung pharmakologisch irrelevanter Plasma- bzw. Harnkonzentrationen leistet, bleibt aufgrund heutiger Erfahrungen festzustellen, dass es keine allgemeingültige Berechnungsformel geben kann, die für alle dopingrelevanten Stoffe gleichermaßen anwendbar ist. Vielmehr bedarf es für jeden Stoff der Kenntnis seiner pharmakologischen Wirkungseigenschaften und Dosierung, seiner pharmakokinetischen Eigenschaften (insbesondere Clearance und Verteilungsvolumen) und selbstverständlich auch der analytischen Möglichkeiten (LOD, LOQ). Basierend auf diesen Informationen kann eine Abschätzung zum Ausscheidungsverhalten und zum Erreichen nicht mehr als wirksam anzusehender Konzentrationen erfolgen. Sicheren Aussagen zu sogenannten Karenzzeiten stehen jedoch Hindernisse entgegen, auf die nachfolgend eingegangen werden soll.

Mit der Applikation einer Arzneimitteldosis wird eine definierte Zahl von Wirkstoffmolekülen verabreicht. So erhält ein Pferd von 500 kg Körpermasse bei bestimmungsgemäßer Dosierung von 80 µg Romifidin/kg KM etwa 10 20 Moleküle dieses Wirkstoffes. Nach vier Eliminationshalbwertzeiten ist der Stoff zwar bereits zu 93,75 % ausgeschieden, jedoch ist die Elimination („bis auf das letzte Molekül“) erst nach 68 Halbwertzeit abgeschlossen. In einer an 10 Pferden durchgeführten Studie wurde für Romifidin eine durchschnittliche terminale Halbwertzeit von 0,8 Stunden ermittelt; Romifidin war demnach nach etwa 2,5 Tagen vollständig ausgeschieden (Hammer 2004). Die pharmakokinetischen Kenndaten streuten bei diesen 10 Pferden jedoch bereits um ±33 %. Somit bewegte sich die Zeitspanne bis zur vollständigen Ausscheidung zwischen 1,5 (etwa 1,5 Tage) bei besonders rascher und 3 Tagen im Falle langsamerer Ausscheidung. Die mit der im Rahmen der Studie validierten Messmethode (HPLC-MS/MS) erreichte Bestimmungsgrenze von 10 ng/ml Plasma beziehungsweise Nachweisgrenze von 8 ng/ml Plasma wurden bereits nach 6 beziehungsweise 7 Halbwertzeiten unterschritten (Abb. 3). Während sich im Plasma verhältnismäßig einheitliche Plasmakonzentrationsverläufe zeigen, fällt bei den Urinproben eine relativ große Streuung der Konzentrationen auf (Abb. 4). Es lässt sich errechnen, dass zum Zeitpunkt des Unterschreitens der Bestimmungsgrenze (Plasma) im Körper der Pferde noch etwa 10 18 Moleküle vorhanden waren. War Romifidin im Plasma nicht mehr nachweisbar (< 8 ng/ml), so befanden sich im Körper dennoch noch etwa 7*10 17 Moleküle. Im Urin lag die Konzentration von Romifidin bei allen behandelten Pferden nach 24 Stunden (30 Halbwertzeiten) unterhalb der Nachweisgrenze; zu diesem Zeitpunkt befanden sich noch etwa 10 11 Moleküle im Organismus. Basierend auf in der Untersuchung zusätzlich erfassten pharmakodynamischen Wirkungen (Atemfrequenz, Körpertemperatur, Schmerzempfinden, Reaktion auf akustische und visuelle Reize, Sedationsgrad) ergibt sich eine Wirkungsdauer von bis zu fünf Stunden. Diese Zeitspanne entspricht mit 6 bis 7 Halbwertzeiten ungefähr der Zeit bis zum Erreichen der Bestimmungs- beziehungsweise Nachweisgrenze im Plasma. Die Möglichkeit zur Ableitung einer Karenzzeit, die für den Einzelfall ein ausreichendes Maß an Sicherheit bieten würde, ist durch die Tatsache erheblich eingeschränkt, dass bereits bei den in die Untersuchung einbezogenen zehn Pferden eine ausgeprägte Streuung auffällig ist, obwohl die Tiere untereinander sehr gut vergleichbar waren und auch unter gleichen Bedingungen gehalten und gefüttert wurden. Für die Gesamtpopulation lässt sich aus einer derartigen Untersuchung mit beschränkter Stichprobenzahl keine absolut sichere Aussage zur Streuung ableiten, so dass eine allgemeingültige Angabe einer Karenzzeit nicht möglich ist. Es kann lediglich angenommen werden, dass die skizzierten Ergebnisse auch den Durchschnitt der Gesamtpopulation widerspiegeln, wobei das Ausmaß eine einzubeziehende Sicherheitsspanne für die Sicherheit einer Karenzzeit bestimmend ist.

Die im zitierten Beispiel nach Toutain und Lassourd (2002) berechnete IPC liegt in Abhängigkeit von dem in die Berechnung einzubeziehenden Dosierungsintervall bei 0,01 bis 0,05 ng/ml; die IUC bei 0,13 bis 0,24 ng/ml. Diese Werte liegen weit unter den erreichten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. Selbst zum Zeitpunkt des Unterschreitens der Konzentration von 0,01 ng/ml Plasma (nach 17 bis 18 Halbwertzeiten) befinden sich noch mehr als 10 14 Moleküle im Organismus. Die Schlussfolgerung aus den für Romifidin vorliegenden Ergebnissen muss daher lauten, dass jeder Nachweis des Stoffes als positiver Dopingbefund gewertet werden muss. Die skizzierten Untersuchungsergebnisse zeigen die gegebene Problematik bei der Ableitung pharmakologisch irrelevanter Wirkstoffkonzentrationen nach dem PK/PD-Modell recht deutlich auf. Eine entsprechende Situation zeigte sich in einer parallel durchgeführten Untersuchung auch für Detomidin, für welches ebenfalls eine IUC unterhalb der Nachweisgrenze ermittelt wurde (Tobias 2004).

Aus den vorgestellten Ergebnissen wird deutlich, dass der Begriff der „Nulltoleranz“ bei strenger Definition nicht korrekt ist, d.h., dass sich ein Teil der verabreichten Dosis zu jeder als Grenzpunkt definierter Zeit noch im Organismus befindet, obwohl der Stoff nicht mehr nachweisbar ist. Unter dem Begriff kann also nur verstanden werden, dass der jeweilige Stoff mit der verwendeten analytischen Methode nicht mehr nachgewiesen werden kann. Die Empfindlichkeit der verwendeten Methode (einschließlich der Methode der Probenaufarbeitung) bestimmt somit die Nachweisgrenze und damit auch die Zeit, die bis zum Erreichen dieser Konzentration vergeht. Es wurde bereits darauf verwiesen, dass die Verbesserungen der analytischen Möglichkeiten eine immer weiter fortschreitende Absenkung dieser Grenze und damit eine teilweise exponentielle Verlängerung der Phase der Nachweisbarkeit herbeiführt.

Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass generelle für jeden Einzelfall Sicherheit bietende Aussagen zu Grenzkonzentrationen oder Karenzzeiten auf der Basis pharmakokinetischer Studien, die stets nur an begrenzten Tierzahlen durchgeführt werden können, gerade in Anbetracht teilweise erheblicher interindividueller Unterschiede in der Gruppe der in die Untersuchung einbezogenen Pferde und insbesondere in der Gesamtpopulation nicht mit absoluter Sicherheit möglich ist. Einheitliche Werte, die für validierte und einheitlich verwendete Analysenmethoden unter Berücksichtigung der oben angeführten Punkte festzusetzen sind, erlauben allerdings eine Berechnung von Ausscheidungszeiten, nach denen diese Werte im Durchschnitt unterschritten sein werden. Basierend auf diesen Werten kann eine Aussage getroffen werden, die eine entsprechende Aussage mit einer statistischen Sicherheit erlaubt, die maßgeblich von der einbezogenen Sicherheitsspanne abhängt. In Analogie zu den Regelungen bei der Untersuchung vom Tier stammender Lebensmittel, wo in Europa mit den MRL-Verfahren einheitliche Grenzwerte festgelegt sind, sollte auch für die Dopinguntersuchungen eine sinnvolle Regelung getroffen werden, wobei festzulegende Werte durchaus mit der aktuellen Nachweisgrenze übereinstimmen können, wenn die ineffekte Plasma- oer Urinkonzentration (IPC, IUC) eines Wirkstoffes beispielsweise unterhalb der Nachweisgrenze liegt (d.h. wenn bei den nachweisbaren Konzentrationen eine pharmakologische Wirkung nicht sicher ausgeschlossen werden kann).

 

Literatur

Toutain, P.L., Lassourd, V. (2002): Equine Veterinary Journal 34, 242-249

Hammer (2004): Diss., Tierärztliche Hochschule Hannover

Tobias (2004): Diss., Tierärztliche Hochschule Hannover

Abb. 1: Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze, Wirkgrenze

 

Abb. 2: Berechnung der effektiven Plasmakonzentration (EPC), der ineffektiven Plasmakonzentration (IPC) und der ineffektiven Urinkonzentration (IUC) nach Toutain und Lassourd (2002) [SF = Sicherheitsfaktor]

Abb. 3: Plasmakonzentrationsverlauf von Romifidin nach einmaliger intravenöser Applikation von 80 µg Romifidin/kg KM bei 10 Pferden

 

Abb. 4: Konzentrationsverlauf von Romifidin im Urin nach einmaliger intravenöser Applikation von 80 µg Romifidin/kg KM bei 10 Pferden (Aufarbeitung mit Hydrolyse)

Tabelle 1: Wirkungsdauer und Zeitspanne der Nachweisbarkeit in Plasma und Urin (Ausscheidungszeit; Abhängigkeit von der Analytik) beim Pferd (Beispiele)